信使rna帽的抗‑反向硫代磷酸类似物的合成和用途
2020-01-15

信使rna帽的抗‑反向硫代磷酸类似物的合成和用途

公开了新的RNA帽类似物,其包含一个或多个硫代磷酸基团。所述类似物还在7‑甲基鸟苷的2’‑O位置处包含修饰,其防止它们在mRNA的体外合成过程中以相反的方向掺入,并因此是“抗‑反向帽类似物”(anti‑reverse cap analog,ARCA)。所述ARCA修饰确保,S原子在翻译和脱帽机器中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。所述新的S‑ARCA类似物对于体内脱帽酶具有抗性。有些S‑ARCA具有相比于不包含硫代磷酸基团的相应类似物而言更高的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S‑ARCA的mRNA引入培养的细胞中时,有些mRNA以相比于用常规类似物m 7 GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度有效地进行翻译。

J·Kowalska等人〃SynthesisandpropertiesofmRNAcapanalogscontainingphosphorothioatemoietyin5',5'-triphosphatechain,〃Nucleos.Nucleot.Nucl.Acids,第24卷,第595-600页(2005)报道了其中用S替代α、β或γ磷酸部分中的〇的三种帽类似物的合成,例如m7GpsppG、m7GpppsG和m7Gpps-CH3PG。这些合成的硫代磷酸帽类似物是帽依赖性翻译的更加稳定的抑制剂,并且对于DcpS脱帽酶具有抗性。然而,无论在体外还是在体内,这些化合物并没有显示出比平常ARCA更高的翻译效率,因为它们可能在很大程度上以相反方向掺入。

四磷酸S-ARCA的合成

虽然用m27AciGppch2PG帽化的mRNA在培养的细胞中更为稳定,但是它具有较低的翻译效率,推测这是因为肥7’3’h3Gppch2pG在体外以比肥7’3’h3GpppG显著更低的亲和力与eiF4E结合。因此,即使它在培养的细胞中更为稳定,但这个优点却被较低的翻译效率给抵消了。

本发明的开发部分地在由国家综合医学研究所(NationalInstituteofGeneralMedicalSciences)给予的基金号R01GM20818下得到美国政府的资助。美国政府享有本发明中的某些权利。

实施例14

Dk1HNMR:δ(ppm)9.14(lH,s)8.08(lH,s),5·99(lH,d),5.813(lH,d);4·70(1H;t),4.64(lH,t),4.54(lH,t),4.45(lH,m),4.35(2H,m),4.29(3H,m),4.07(3H,s),3.60(3H,s);31PNMR:530.2(lP,t,Py),-11.1(lP,dd,P5),-11.9(lP,dd,Pa),-23.8(IP,ά,Ρβ)

在HCl1细胞中用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA更有效地被募集至多核糖体

使用加帽的48-nt寡核苷酸(萤光素酶mRNA的截短形式(48个核苷酸))作为底物来测量Dcp2活性。在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达GST_hDcp2并进行纯化,如Z.Wang等人,〃ThehDcp2proteinisamammalianmRNAdecappingenzyme,〃Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第99卷,第12663-12668页(2002)所描述的。首先使加帽的寡核苷酸在37°C下在脱帽缓冲液(IOmMTris-HCl(pH7.5)UOOmM乙酸钾、2mM乙酸镁、0.5mMMnCl2、2mM二硫苏糖醇和0.ImM精胺)中经历使用GST-hDcp2来进行的消化2小时。参见C.Piccirillo等人,"FunctionalcharacterizationofthemammalianmRNAdecappingenzymehDcp2,〃RNA,第9卷,第1138-1147页(2003)。然后,将反应混合物用等体积的苯酚提取一次和用氯仿提取两次,并且用乙醇来沉淀出RNA。将脱帽反应的产物进一步用核糖核酸酶的混合物(RiboShredder;Epicentre)在37°C下消化1小时。产物在4.6X250-mmPartisi110SAX/25柱(Whatman)上通过阴离子交换HPLC进行解析。梯度的组成如下:水,1分钟;至112mMKH2P〇4的线性梯度(pH4.5),20分钟;112-450mMKH2P〇4的线性梯度,15分钟;450mM至1.5MKH2PO4的线性梯度,15分钟;和以1.5MKH2PO4的等度洗脱,9分钟;全部以Iml/分钟的流速。

图3描绘了K-ARCAm27’2’—QGppspG(Dl和D2)的合成。

作为帽依赖性翻译的体内抑制剂的用S-ARCA帽化的mRNA片段

帽依赖性翻译的抑制

J·Kowalska等人〃SynthesisandpropertiesofmRNAcapanalogscontainingphosphorothioatemoietyin5',5'-triphosphatechain,〃Nucleos.Nucleot.Nucl.Acids,第24卷,第595-600页(2005)报道了其中用S替代α、β或γ磷酸部分中的〇的三种帽类似物的合成,例如m7GpsppG、m7GpppsG和m7Gpps-CH3PG。这些合成的硫代磷酸帽类似物是帽依赖性翻译的更加稳定的抑制剂,并且对于DcpS脱帽酶具有抗性。然而,无论在体外还是在体内,这些化合物并没有显示出比平常ARCA更高的翻译效率,因为它们可能在很大程度上以相反方向掺入。